دانلود مقاله روش شناسائی یرسینیا انتروکلی تیکا در مواد غذائی

جنس یرسینیا با پذیرفتن نام‌های متعددی چون فلاوباکتریوم پسودومولئی، باکتریوم انتروکلی تیکا، پاستور لاپسودوتوبرکلوزیس، پاستور X و ژرم X نهایتا از سال 1974 از خانواده پاستور لاسه جدا و به همراه سه گونه اصلی یرسینیاپستیس، یرسینیا پسودوتوبرکلوزیس و یرسینیا انتروکلی تیکا بطور قطعی در خانواده آنتروباکتریا سه جای گرفت.

این باکتریها از جمله بیماری زاهای مشترک انسان و دام هستند و مهم ترین گونه‌ای که نقش آن در بیماری زایی انسان از سال 1965 به اثبات رسیده است یرسینیا انتروکلی تیکا می‌باشد، شیر خام، گوشت، سبزیجات و آب می‌تواند بعنوان منبع آلودگی این باکتری مطرح باشد.

یرسینیا انتروکلی تیکا می‌تواند عامل بیماری معدی روده‌ای، آدنیت مزانتریک، اریتم گره‌دار عفونت خونی و پلی آرتریت باشد. این ارگانیسم، کوکو باسیلی است گرم منفی، بدون کپسول، بی‌هوازی اختیاری بطول 1-3 میکرومتر و عرض 0/5 - 0/8 میکرومتر که حرکت آن فقط در دمای پائین تر از 30 درجه سلسیوس به کمک فلاژل‌های پیرامونی صورت می‌گیرد. دمای مناسب رشد آن 28-29 درجه سلسیوس PH مناسب آن 7/2 - 7/4 است و مانند اکثر آنتروباکتریاسه‌ها گلوکز را بدون گاز تخمیر می‌کند و اکسیداز منفی است.

سروتیپ‌های جدیدی چون 0:13a; 13b, 0:4,32, 0:5,27, 0:21 بیماری‌زا تشخیص داده شده‌اند. بیشترین سروتیپ‌های بیماری‌زا 0:3 0:8, 0:9 می‌باشد.

از نظر سرولوژی آگلوتیناسیون‌های متقاطع با ارگانیسم‌هایی مانند سالمونلا، بروسلا، شیگلا، اشری شیاکلی و ویبربو گزارش شده است.

1 ـ هدف و دامنه کاربرد
هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است . این روش در مورد فرآورده‏های غذایی انسان و دام کاربرد دارد . 2 ـ واژه‏ها و تعاریف در این استاندارد واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند :
هدف از تدوین این استاندارد ارائه روش جداسازی و شناسایی یرسینیا انتروکلی تیکای بیماری زا برای انسان است . این روش در مورد فرآورده‏های غذایی انسان و دام کاربرد دارد .

2 ـ واژه‏ها و تعاریف
در این استاندارد واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند : 2 ـ 1 ـ یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنه‏های ویژه‏ای ایجاد می‏نمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت می‏کند .
در این استاندارد واژه‏ها با تعاریف زیر بکار می‏روند :

2 ـ 1 ـ یرسینیا آنتروکلی تیکای بیماری زا

باکتریهای سرما گرایی هستند که اگر طبق روش مشروح در این استاندارد آزمایش شوند روی محیط های جامد انتخابی پرگنه‏های ویژه‏ای ایجاد می‏نمایند که از نظر خواص بیوشیمیایی با معیارهایی بیماری زائی این استاندارد مطابقت می‏کند .

2 ـ 2 ـ شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکا

شامل حضور یا عدم حضور این باکتری در مقدار معینی از فرآورده غذایی است که بر طبق روش مشروح در این استاندارد تعیین می‏شود .

3 ـ اساس آزمایش
شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‏گیرد . 3 ـ 1 ـ غنی سازی در محیط مایع انتخابی 3 ـ 1 ـ 1 ـ کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر :
شناسایی یرسینیا آنتروکلی تیکای احتمالا بیماری زا در طی سه مرحله پی در پی زیر صورت می‏گیرد .

3 ـ 1 ـ غنی سازی در محیط مایع انتخابی

3 ـ 1 ـ 1 ـ کشت نمونه مورد آزمون در دو محیط غنی کننده زیر :

الف آبگوشت نمک های صفراوی و سوربیتول و پپتن

Peptone Sorbitol and Bile salts Broth (PSB )

ب : آبگوشت ایرگازان ـ تیکارسیلین وکلرات پتاسیم

Jrgasan ticarcillin and Potassium chlorate broth (ITC)

3 ـ 1 ـ 2 ـ گرمخانه گذاری

کشت (PSB) در دمای 25 ـ 22 درجه سلسیوس بمدت 3 تا 5 روز

کشت (ITC) در دمای 25 ـ 22 درجه سلسیوس بمدت 2 روز (48 ساعت )

3 ـ 2 ـ کشت در محیطهای جامد

کشت سطحی از محیطهای PSB.ITC بترتیب در محیطهای جامد زیر :

3 ـ 2 ـ 1 ـ محیط سفسولودین ـ ایرگازان و نووبیوسین آگار

Cefsulodin Irgasan and novobiocin agar (CIN)

3 ـ 2 ـ 2 ـ محیط سالمونلا ـ شیگلا آگار حای ذرکسی کلات سدیم و کلرور کلسیم

Salmonella / Shigella agar with Sodium desoxychlate and Calcium chloride (SSDC)

3 ـ 2 ـ 3 ـ گرمخانه گذاری

محیطهای CIn و SSDC در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید . پس از 24 ساعت و در صورت لزوم پس از 48 ساعت متناسب با محیط , کشت ها را به منظور حضور پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا بررسی کنید .

3 ـ 3 ـ تایید

در این مرحله روی پرگنه‏های مشکوک به یرسینیا آزمایش‏های بیوشیمیایی , آزمایش های خاص منطبق با معیارهای بیماری زایی و در صورت امکان آزمایش های سرولوژیکی برای تایید انجام می‏شود .

به راهنمای روش کار مراجعه شود .

4 ـ محیطهای کشت ومعرف های لازم
4 ـ 1 ـ کلیات بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرف‏ها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است . 4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده
4 ـ 1 ـ کلیات

بدلیل تعداد زیاد محیطهای کشت و معرف‏ها و برای وضوح شرح آزمایش , ترکیبات محیطها , جزییات مربوط به تقسیم و نگهداری آنها به صورت پیوست در استاندارد آمده است .

4 ـ 2 ـ محیطهای غنی کننده

4 ـ 2 ـ 1 ـ محیط مایع حاوی پیتن , سوربیتول و نمکهای صفرا (PSB)

4 ـ 2 ـ 2 محیط مایع حاوی ایرگازان ـ تیکارسیلین وکلرات پتاسیم (ITC)

4 ـ 3 ـ محیطهای کشت

4 ـ 3 ـ 1 ـ سفسولودین ـ ایرگازان و نووبیوسین حاوی آگار (CIN)

4 ـ 3 ـ 2 ـ سالمونلا ـ شیگلا آگار حاوی ذرکسی کلات سدیم و کلرور سدیم (SSDC)

4 ـ 3 ـ 3 ـ نوترنیت آگار

4 ـ 4 ـ محیط های شناسایی ومعرفها

4 ـ 4 ـ 1 ـ محیط کشت اوره تریپتوفان

4 ـ 4 ـ 2 ـ معرف شناسایی تریپتوفان دی آمیناز

4 ـ 4 ـ 3 ـ کلیگر آگار

4 ـ 4 ـ 4 ـ معرف تشخیص اکسیداز

4 ـ 4 ـ 5 ـ محیط های کشت دکربوکسیلاز

4 ـ 4 ـ 5 ـ 1 ـ محیط کشت لایزین دکربوکسیلاز

4 ـ 4 ـ 5 ـ 2 ـ محیط کشت اورنی تین دکربوکسیلاز

4 ـ 4 ـ 6 ـ محیط برای تخمیر قندها ( ساکارز ( رامنوز یا سالیسین )

4 ـ 4 ـ 7 ـ محیط سیمون سیترات

4 ـ 4 ـ 8 ـمحیط صفرا و اسکولین آگاردار

4 ـ 4 ـ 9 کازئین سویا اگاردار

4 ـ 4 ـ 10 ـ کارتین سویا آگار دار برای شناسایی آمیداز

4 ـ 4 ـ 11 ـ محلول سولفات آمونیوم و آهن دو ظرفیتی برای شناسایی پیرازین آمیداز

مازئین سویا آگاردار حاوی منیزیم وآگزالات

4 ـ 5 ـ سرم فیزیولوژی

4 ـ 6 ـ پتاسیم هیدروکساید در سرم فیزیولوژی

4 ـ 7 ـ محیط SIM آگار

5 ـ وسایل ضروری
یادآوری : بجای ظرف شیشه‏ای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب می‏توان استفاده کرد. . 5 ـ 1 ـ وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو ) 5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.
یادآوری : بجای ظرف شیشه‏ای چند بار مصرف از وسایل یکبار مصرف بشرط دارابودن ویژگیهای مناسب می‏توان استفاده کرد. .

5 ـ 1 ـ وسیله سترون کردن خشک ( آون ) یا سترون کردن مرطوب ( اتوکلاو )

5 ـ 2 ـ گرمخانه قابل تنظیم در 22±1درجه سلسیوس و 25±1درجه سلسیوس.

5 ـ 3 ـ قفسه خشک کردن یا آون دارای تهویه هوا با جابجایی و قابل تنظیم در 37±1 درجه و 55±1 درجه سلسیوس

5 ـ 4 ـ حمام آب قابل تنظیم در دمای 45±0/5درجه سلسیوس و 50±0/5درجه سلسیوس

5 ـ 5 ـ لوله‏های آزمون با ابعاد 180*18 و 180*9 و 50*12 میلی متر

5 ـ 6 ـ ظروف شیشه ای و بطری های با گنجایش مناسب

5 ـ 7 ـ ظروف پتری شیشه‏ای یا پلاستیکی بقطر 100 ـ 90 میلی متر

5 ـ 8 ـ پی پت‏های 1 و 10 میلی لیتری با درجه بندی 0/1 میلی لیتر

5 ـ 9 ـ مکنده‏های لاستیگی ( پوآر ) مخصوص پی پت

5 ـ 10 ـ حلقه کشت بقطر تقریبی 3 میلی متر و سوزن کشت سر صاف از جنس پلاتین / ایریدوم یا نیکل / کروم و یا پی پت پاستور شیشه‏ای بجای سوزن کشت .

یادآوری : حلقه و سوزن کشت یکبار مصرف می‏تواند استفاده شود حلقه کشت از جنس نیکل / کرم برای انجام آزمون اکسیداز مناسب نیست .

5 ـ 11 ـ PH متر بادقت ±0/1 واحد PH در 25 درجه سلسیوس

5 ـ 12 ـ منبع نور مناسب برای تابش مورب

5 ـ 13 ـ ذره بین یا میکروسکوپ

5 ـ 14 ـ مخلوط کن ( استوماکر )

6 ـ نمونه برداری
نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایش‏های میکربی صورت گیرد . نمونه‏ای که به آزمایشگاه می‏رسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد . 7 ـ آماده کردن نمونه نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .
نمونه برداری از فرآورده باید با رعایت اصول مربوط به نمونه برداری فرآورده غذایی برای آزمایش‏های میکربی صورت گیرد . نمونه‏ای که به آزمایشگاه می‏رسد باید معرف واقعی کالا بوده و در حین نمونه برداری و حمل و نقل دچار آسیب دیدگی و تغییر نشده باشد .

7 ـ آماده کردن نمونه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود . 8 ـ روش آزمایش 8 ـ 1 ـ سوسپانسیون‏های اولیه
نمونه مورد آزمون با توجه به استاندارد ملی شماره 356 ایران (( آماده کردن نمونه غذایی و تهیه رقم اعشاری نمونه برای آزمایش های میکربی )) آماده شود .

8 ـ روش آزمایش
8 ـ 1 ـ سوسپانسیون‏های اولیه 8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود . 8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسیون دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت وزن به حجم یا حجم به حجم تهیه کنید .
8 ـ 1 ـ سوسپانسیون‏های اولیه

8 ـ 1 ـ 1 ـ مقدار معینی ( وزن ی حجم نمونه ) از نمونه مورد آزمایش را به حجم مشخصی از محیط PSB منتقل کنید بطوری که رقت یکدهم وزن به حجم یا حجم به حجم بدست آید و بعد با استوماکر آن را مخلوط کنید تا یکنواخت شود .

8 ـ 1 ـ 2 سوسپانسیون دیگری از نمونه , با محیط ITC با رقت وزن به حجم یا حجم به حجم تهیه کنید .

8 ـ 2 ـ غنی سازی 1

8 ـ 2 ـ 1 ـ محیط PSB کشت شده را در 25 ـ 22 درجه سلسیوس بمدت 5 روز بدون هم زدن و 2 تا 3 روز با هم زدن قرار دهید .

8 ـ 2 ـ 2 ـ محیط ITC کشت شده را در 25 درجه سلسیوس برای 2 ورز (48 ساعت ) گرمخانه گذاری کنید .

8 ـ 3 ـ کشت

8 ـ 3 ـ 1 ـ با حلقه کشت از محیط (PSB) بردارید و روی محیط جامد (CIN) طوری کشت دهید که پرگنه های مجزا حاصل شود .

8 ـ 3 ـ 2 ـ با پی پت سترون , 0/5 میلی لیتر از کشت PSB را به 4/5 میلی لیتر محلول پتاسیم هیدروکساید ( محیط شماره 20 پیوست ) بیفزایید و خوب مخلوط کنید و بعد از 20 ثانیه با حلقه کشت از ان بردارید و در سطح محیط (CIN) طوری کشت دهید که پرگنه‏های مجزا حاصل شود .

8 ـ 3 ـ 3 ـ با حلقه کشت از ITC کشت شده بردارید و در سطح جامد SSDC برای حصول پرگنه‏های مجزا کشت دهید .

8 ـ 3 ـ 4 ـ ظروف پتری بندهای 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 ـ و 8 ـ 3 ـ 3 را بطور وارونه در گرمخانه در دمای 30 درجه سلسیوس برای 24 ساعت قرار دهید .

8 ـ 3 ـ 5 ـ ظروف پتری را از گرمخانه خارج و آنها را به منظور شناسایی پرگنه های ویژه یرسینیا آنتروکلی تیکا در نور مایل (45 درجه ) با ذره بین بررسی کنید .

الف - پرگنه های یرسینیا آنتروکلی تیکا در محیط CIN

کوچک ( برابر یا کوچکتر از یک میلی متر ) صاف یا مرکز قرمز و حاشیه شفاف و در زیر نور مایل با ظاهری گرانول دار ریز و بدون قوس و قزح است .

ب - پرگنه‏های یرسینیا آنتروکلی تیکا در محیط SSDC

کوچک ( برابر یا کوچکتر از یک میلی متر ) خاکستری رنک یا حاشیه نامشخص و در زیر نور مایل با ظاهری دانه دار و ریز و بدون قوس و قزح است

8 ـ 3 ـ 6 ـ اگر پرگنه های یرسینیاریز و یا کمرنگ باشند و یا دیده نشوند ظروف پتری را برای 24 ساعت دیگر گرمخانه گذاری کنید .

8 ـ 3 ـ 7 ـ انتخاب پرگنه‏ها

از هر ظرف پتری هر یک از محیطهای انتخابی بند 8 ـ 3 ـ 1 و 8 ـ 3 ـ 2 و 8 ـ 3 ـ 3, 5 پرگنه مشکوک بردارید . اگر در یک ظرف 5 پرگنه مشکوک یا کمتر وجود داشت تمام آنها را برای تایید بردارید .

8 ـ 3 ـ 8 ـ جدا سازی پرگنه‏ها

پرگنه‏های انتخاب شده را روی محیط نوتر نیت آگار ( محیط شماره 5 پیوست ) کشت خطی دهید و سپس ظروف پتری را برای 24 ساعت و در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید . پس از این مدت ظروف از گرمخانه خارج و آنها را در دمای ( 5 ـ 0) درجه سلسیوس ( دمای یخچال ) برای آزمایش‏های تاییدی و بیماری زایی نگهداری کنید .

9 ـ آزمایش های بیو شیمیایی
از کشت های خالص برای آزمایش های زیر استفاده می‏شود . 9 ـ 1 ـ آزمایش های تشخیص بیو شیمیایی 9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمایش اوره از
از کشت های خالص برای آزمایش های زیر استفاده می‏شود .

9 ـ 1 ـ آزمایش های تشخیص بیو شیمیایی

9 ـ 1 ـ 1 ـ آزمایش اوره از

با میله شیشه‏ای یا سوزن کشت از پرگنه‏های مجزا شده در محیط نوترنیت آگار برداریدو بطور دقیق زیر محیط مایع اوره ترپیتوفان ( محیط شماره 6 پیوست ) کشت دهید و برای 24 ساعت در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .

نتیجه ـ رنگ صورتی بنفش نشان دهنده واکنش مثبت اوره آز است .

رنگ زرد نارنجی نشان دهنده واکنش اوره از است .

9 ـ 1 ـ 2 ـ آزمایش تریپتوفان دی آمیناز

سه قطره ازمعرف شناسایی تریپتوفان دی آمیناز ( شماره 7 پیوست ) را به کشت حاصل از بند 9 ـ 1 ـ 1 بیفزایید .

نتیجه : رنگ قهوه‏ای نشان دهنده واکنش مثبت است .

9 ـ 1 ـ 3 ـ کلیگلر آگار

از پرگنه‏های خالص شده روی نوترینت آگار برداشته و در سطح محیط مورب کلیگلر آگار ( شماره 8 پیوست ) بطور خطی کشت دهید و بعد سوزن را به عمق محیط فرو برید . سپس آن را در دمای 30 درجه سلسیوس برای 24 ساعت تا 48 ساعت گرمخانه گذاری کنید و . سپس تغییرات حاصله در محیط را بشرح زیر مورد بررسی قرار دهید و نتیجه‏گیری کنید .

9 ـ 1 ـ 4 آزمایش اکسیداز

با میله شیشه‏ای قسمتی از پرگنه مجزا و خالص یرسینیا را بردارید و روی یک کاغذ صافی مرطوب شده با معرف اکسیداز ( شماره 9 پیوست ) یا روی دیسک قابل دسترس تجارتی تماس دهید ( از سوزن کشت یا حلقه کشت نیکل / کروم برای این منظور استفاده نشود).

نتیجه : چنانچه رنگ کاغذ صافی در مدت 10 ثانیه ارغوانی روشن , بنفش و یا آبی تیره نشود آزمایش اکسیداز منفی است .

توجه ـ علاوه بر آزمایش‏های بیوشیمیایی فوق از آزمون حرکت نیز جهت تشخیص یرسینیا می‏توان استفاده کرد .

9 ـ 1 ـ 5 ـ آزمایش حرکت

از پرگنه های مجزا و خالص یریسنیا بردارید و بطور عمودی در دو لوله محتوی محیط SIM آگار ( شماره 21 پیوست ) فرو برید و یکی از دو لوله را در 25 درجه و دیگری را در 37 درجه سلسیوس برای 24 ساعت گرمخانه گذاری کنید و پس از این مدت آنها را بررسی کنید .

نتیجه : در صورتی که باکتری در محیط کشت به طرفین انتشار یافته باشد و کدورت در آن منطقه حاصل شده باشد آزمایش حرکت مثبت است .

9 ـ 1 ـ 6 ـ انتخاب پرگنه‏ها

پرگنه هایی که خصوصیات مندرج در جدول شماره یک را دارا هستند برای آزمایش‏های تاییدی انتخاب ‏شوند .

(1) – سویه های اوره آز منفی از یرسینیا انتروکلی تیکا گزارش شده اند که بیماری زا نیستند .

(2) – در موقع تشکیل گاز از گلوکز ممکن است کمی حباب هوا ایجاد شود اگر چه یرسینیا معمولا قندها را بدون ایجاد گاز تخمیر میکند ولی بعضی از سویه های یرسینیا ( بیووار 3 ) ممکن است یک یا دو حباب ایجاد کند ( ایجاد گاز ضعیف )

(3) – برخی از سویه های یرسینیا انتروکلی تیکا لاکتوز + از فراوره های لبنی جدا شده اند که معمولا بیماری زا نیستند .

9 ـ 2 ـ آزمایش‏های تاییدی بیوشیمیایی

9 ـ 2 ـ 1 ـ آزمایش لایزین دکربوکسیلاز

با سوزن با حلقه کشت یا میله شیشه‏ای از پرگنه هایی مجزا و خالص شده روی نوترنیت آگار بردارید و در محیط لایزین دکربوکسیلاز ( شماره 10 پیوست ) کشت دهید و برای 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .

نتیجه : پیدایش رنگ بنفش در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و پیدایش رنگ زرد در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش منفی است .

9 ـ 2 ـ 2 ـ آزمایش اورنی تین دکربوکسیلاز

از پرگنه‏های خالص بردارید و در محیط اورنی تین ( شماره 11 پیوست ) کشت دهید و 24 ساعت در 30 درجه سلسیوس گرمخانه گذاری کنید .

نتیجه : پیدایش رنگ بنفش پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش مثبت است و پیدایش رنگ زرد در محیط پس از گرمخانه گذاری نشان دهنده واکنش منفی است .

9 ـ 2 ـ 3 ـ تخمیر ساکارز و رامنوز

فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد

تعداد صفحات این مقاله 20   صفحه

پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید